การโคลนยีน DNA สายผสมที่ได้จากการตัดและต่อนี้ยังไม่สามารถทำงานได้ต้องมีวิธีการที่จะดำรง DNA สายผสมให้คงอยู่และเพิ่มจำนวนเพื่อใช้ในการศึกษาว่า สาย DNA เหล่านั้นควบคุมการสร้างโปรตีนชนิดใดและศึกษาว่าDNA ยีนอะไรบ้าง สิ่งที่จำเป็นคือ จะต้องเพิ่มDNA ในบริเวณดังกล่าวให้มากพอที่จะศึกษาได้ การเพิ่ม DNA ที่เหมือนกันนั้นเรียกว่า “การโคลนดีเอ็นเอ (DNA cloning)” หาก DNA
บริเวณดังกล่าวเป็นยีนก็อาจเรียกว่า “การโคลนยีน (gene cloning)” การโคลนยีนโดยอาศัยพลาสมิดของแบคทีเรีย การโคลนยีนวิธีหนึ่งที่เป็นที่นิยมกัน คือ อาศัยวิธีการเพิ่มจำนวนชุดของ DNA ในพลาสมิด (plasmid) ของแบคทีเรีย ซึ่งถือว่าเป็น DNA พาหะ (vector) สำหรับการโคลน DNA อย่างหนึ่งในแบคทีเรีย 1 เซลล์ อาจมีพลาสมิด1 – 300 ชุด เมื่อนำเซลล์แบคทีเรียไปเลี้ยงเพื่อเพิ่มจำนวนชุดของพลาสมิดก็จะ เพิ่มขึ้นด้วย ซึ่งส่วนของ DNA ที่ต้องการที่แทรกไว้ไนพลาสมิดก็จะเพิ่มขึ้นตามโดยปริยาย
หากส่วนของDNA ที่แทรกไว้เป็นยีนก็อาจนำไปใช้ประโยชน์ต่อไป
ภาพแสดงการโคลนDNA โดยอาศัยพลาสมิด
สิ่งที่ต้องใช้ในการทดลอง คือ 1. DNA แม่แบบ (DNA template)ซึ่งเป็น DNA ที่ต้องการโคลนหรือเพิ่มจำนวน 2. DNA ไพรเมอร์ (DNA primer) เป็น DNAสายสั้นๆ ที่ใช้เกาะกับ DNA ที่ต้องการโคลนเพื่อเป็นจุดเรื่มต้นในการสังเคราะห์สายDNA 3. นิวคลีโอไทด์ทั้ง 4 ชนิด ประกอบด้วย dATP (A) , dGTP (G) , dCTP (C) และ dTTP (T) 4. เอนไซม์ DNA พอลิเมอเรส ชนิดพิเศษ
ขั้นตอนของการทำงานของเครื่องเทอร์มอไซเคลอร์ โดยใช้เทคนิค PCR 1. ขั้นตอนแรกนี้เรียกว่า “Denaturation” เพิ่มอุณหภูมิของเครื่องให้สูงขึ้นจนสาย DNA สายคู่ที่เป็นแม่แบบแยกออกจากกันเป็นสายเดี่ยว(ขั้นนี้อุณหภูมิประมาณ 90 ◦) 2. ขั้นตอนที่สองเรียกว่า “Annealing” ลดอุณหภูมิลง (เหลือประมาณ 55 ◦) จะทำให้ DNA ไพรเมอร์จับกับ DNA แม่แบบสายเดี่ยวแต่ละสายในตำแหน่งที่เป็นจุดเริ่มต้นในการสังเคราะห์ DNA ด้วยพันธะไฮโดรเจน 3. ขั้นตอนที่สามเรียกว่า “Extension” ปรับอุณหภูมิให้เหมาะสมต่อการทำงานของเอนไซม์ DNA พอลิเมอเรส เพื่อให้สร้างสาย DNA สายคู่เพิ่มขึ้น(ช่วงอุณหภูมิที่เหมาะสมต่อการทำงานของเอนไซม์DNA พอลิเมอเรส คือ ประมาณ 72 ◦-75 ◦) 4. เริ่มกระบวนการในขั้นที่1 ใหม่จะได้ DNA สายคู่ 2 สาย เพิ่มเป็น 4 สายคู่ 8 สายคู่ และ 16 สายคู่ ตามลำดับไปเรื่อยๆ จนมากพอกับความต้องการ
จะเห็นได้ว่าเทคนิคPCR นี้จะเพิ่มปริมาณ DNA ที่ต้องการที่มีปริมาณน้อยให้มากได้อย่างรวดเร็ว แต่อย่างไรก็ตามเทคนิค PCR ยังมีข้อจำกัดอยู่ คือ ขั้นตอนการแสดงของยีน เช่น การสร้างโปรตีนและขั้นตอนการตรวจสอบความผิดพลาดของ DNA ที่สร้างขึ้น เนื่องจากเอนไซม์ที่ใช้ในปฏิกิริยานี้บางชนิดไม่มีการตรวจสอบลำดับนิวคลีโอไทด์ของ DNA เหมือนในระบบของเซลล์สิ่งมีชีวิต
ที่มา : //sites.google.com
การตัดและเชื่อมสายดีเอ็นเอเป็น DNA สายผสมนั้นไม่เพียงพอที่จะสามารถนำไปประยุกต์ใช้ได้ แต่ยังต้องมีวิธีการที่จะสามารถดำรง
DNAสายผสมให้คงอยู่ และเพิ่มจำนวนเพื่อใช้ในการศึกษาว่า สาย DNA เหล่านั้นควบคุมการสร้างโปรตีนชนิดใดและศึกษาว่า DNA มียีนอะไรบ้าง สิ่งที่จำเป็นคือจะต้องเพิ่มจำนวน DNA ในบริเวณดังกล่าวให้มากพอที่จะศึกษาได้ การเพิ่มจำนวนของ DNA ที่เหมือนๆกัน นั้นเรียกว่า การโคลนดีเอ็นเอ (DNA cloning) และหาก DNA บริเวณดังกล่าวเป็นยีน ก็อาจเรียกว่า การโคลนยีน (gene cloning)
18.2.1
การโคลนยีนโดยอาศัยพลาสมิดของแบคทีเรีย การโคลนยีนวิธีหนึ่งที่เป็นที่นิยมกัน คือ อาศัยวิธีการเพิ่มจำนวนชุดของ DNA ในพลาสมิด (plasmid) ของแบคทีเรีย ซึ่งถือว่าเป็น DNA พาหะ(vector) สำหรับการโคลน DNA อย่างหนึ่งในแบคทีเรีย 1 เซลล์ อาจมีพลาสมิด 1 ถึง 300 ชุด เมื่อนำเซลล์แบคทีเรียไปเลี้ยงเพื่อเพิ่มจำนวน ชุดของพลาสมิดก็เพิ่มขึ้นด้วย ซึ่งส่วนของ DNA ที่ต้องการแทรกไว้ในพลาสมิดก็จะเพิ่มขึ้นตามโดยปริยาย หากส่วนของ DNA ที่แทรกไว้เป็นยีนก็อาจนำไปใช้ประโยชน์ต่อไป
1. การแยกเม็กพลาสมิดที่จะนำมาใช้
2. แทรกสาย DNA ที่มียีนที่ต้องการ
3.
นำพลาสมิดที่เป็นพาหะใส่ใน
4. โคลนยีนโดยอาศัยพลาสมิดของ เป็นพาหะ และ DNA ให้แก่พลาสมิดที่เป็นพาหะ เซลล์ของแบคทีเรียแบคทีเรีย ไปเพาะเลี้ยงแล้วจากสิ่งมีชีวิตที่เลี้ยงให้พลาสมิดจำลองตัวเอง ในเซลล์ของแบคทีเรีย
การโคลนยีนโดยอาศัยพลาสมิดของแบคทีเรียเริ่มจาก การตัดยีนหรือ DNA ที่ต้องการศึกษาด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะแล้วนำมาเชื่อมต่อกับ DNA พาหะหรือเวกเตอร์ (vector) เช่น พลาสมิดได้เป็น DNA รีคอมบิแนนท์ แล้วถ่ายโอน DNA รีคอมบิแนนท์ที่ได้เข้าสู่เซลล์เจ้าบ้านมีการเพิ่มจำนวนยีนหรือ DNA นี้จะเพิ่มจำนวนตามเซลล์เจ้าบ้านด้วย เซลล์เจ้าบ้านที่ที DNA รีคอมบิแนนท์เหมือนๆ กัน เรียกว่า โคลน (clone)
//www.vcharkarn.com/lesson/1312
//biology.ipst.ac.th/?p=3084